Western印跡法（Western blot）或稱“蛋白質轉漬法”、“免疫印跡法”（immunoblot）或“西式吸印雜交”，是在分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

       利用特定抗體能夠專一結合其抗原蛋白質的原理來對樣品進行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息，來分析檢測特定蛋白質的生物學檢測技術。

西方點墨法使用抗體識別修改的硫辛酸蛋白

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       本文通過以下幾點闡述麥克林蛋白質免疫印跡試劑的種類、反應原理及性質：

       1、原理

       2、 實驗步驟

       3、分類

       4、麥克林蛋白質免疫印跡相關試劑產品介紹

原理

       蛋白質免疫印跡法與Southern或Northern雜交方法類似，但免疫印跡法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE（根據分子大?。┓蛛x的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

實驗步驟

       實驗大致分為鑄膠、跑膠、轉漬、接一級抗體、接二級抗體以及壓片幾個部分。

      1、組織準備

       樣本可以從整個組織或者細胞培養物中獲得。固體組織首先需要被機械性的破碎，可以使用攪拌器（對于較大體積的樣本），勻質機（對于小體積的樣本），或者利用超聲波粉碎。細胞也可以通過上述方式機械性的被破開。當然病毒及環境樣本也可以是蛋白的來源，因此蛋白質免疫印跡法并不僅限于細胞研究。

       合適的清潔劑、鹽類和Buffer都可以被用于裂解細胞以及溶解蛋白。蛋白酶和磷酸酶抑制劑經常被添加進去，以防護樣品被其自身的酶消化掉。組織準備經常在低溫條件下進行，以避免蛋白變性和降解。

       生物化學與機械技術（包括各種形式的過濾和離心）的結合，可用于分離不同的細胞室與細胞器。

      2、凝膠電泳

       樣本中的蛋白質通過凝膠電泳進行分離。蛋白質可以通過等電點（pl），分子量，電荷，以及上述因素的組合進行分離。分離的實際效果取決于樣本的處理和凝膠的性質。這是用來識別某種蛋白的一個非常有用的方法。

       最常見的凝膠電泳方式是采用聚丙烯酰胺凝膠和十二烷基硫酸鈉(SDS)作為緩沖負載的組合。SDS-PAGE（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳）能夠保存處在變性狀態下的多肽，這些多肽由蛋白質被強還原劑還原而失去了二三級結構產生（例：從二硫鍵[S-S]到巰基[SH and SH]），通過他們不同的分子量，從而將蛋白質分離。采樣蛋白被帶負電荷的SDS包裹，并通過凝膠的丙烯酰胺網格移動到帶正電的電荷上。較小的蛋白質會更快的遷移通過這個網格，因此蛋白質是通過大?。ㄍǔＳ们У罓栴D，kDa作為量度單位）進行分離的。丙烯酰胺濃度決定了凝膠的分辨率：丙烯酰胺濃度越大，較低分子量的蛋白質的分辨率越好。丙烯酰胺濃度越低，高分子量的蛋白質的分辨率越好。蛋白質通常在凝膠上只沿一維做線性運動形成印痕。

       樣品被加載到凝膠的泉點。第一道通常是預留給標記物或者梯度物的，它們是一些市售的蛋白質混合物，具有標定的分子量，能形成典型可見的彩色染色條帶。當電壓被施加在凝膠上，蛋白質透過其以不同的速度進行遷移，取決于蛋白質的大小。這些不同的前進速率（不同的電泳遷移率）在每個道內單獨形成條帶。

       它也可以使用兩維（2-D）的凝膠，蛋白質從一個單一樣品中沿兩個維度傳播。蛋白質按等電點（蛋白質解離成陰陽離子的趨勢或程度相同，使得凈電荷成中性，此時的pH值即為等電點）在第一個維度分離，并根據其分子量在第二個維度中分離。

      3、轉漬

       要讓抗體成功對蛋白質產生反應，就要將蛋白質從凝膠中轉移到用硝化纖維或聚偏二氟乙烯（PVDF）制成的膜。轉漬蛋白質時，最常用的方法稱為"電印跡"(Electroblotting)，即運用電流，從凝膠中牽引出帶負電荷的蛋白質，使其向帶正電荷的陽極方向移動，進入PVDF或硝化纖維膜內。蛋白質自凝膠移入膜內時，可維持其在凝膠內形成的結構。較舊的轉漬方法，則是在凝膠上先放一塊膜，再放一疊濾紙，然后，將其整疊移至緩沖溶液中，溶液在毛細管作用下會帶動蛋白質，一同由下而上進入濾紙。但實際上由于耗時長，該方法并不常用。 不論采用何種方法，轉漬完成后，蛋白質便會顯露于薄膜上，可供檢測。

      4、封閉

       由于膜能結合蛋白質，所以抗體以及目標蛋白都可以結合到膜上，也因此我們必須防止膜和抗體的反應發生。把膜放在稀釋的蛋白質溶液中（比如3-5%的牛血清蛋白、脫脂牛奶、TBS或者I-Block）可以阻擋非特定的結合。稀釋溶液中的蛋白會把膜上沒有與目標蛋白結合的地方全部結合，因此加了抗體之后，膜上就沒有空間去結合其他非目標蛋白。阻攔是實驗最后的鋪墊，可以使結果更清晰，排除錯誤可能性。

      5、檢測

       在檢測過程中，使用被修飾的抗體作“探針”來標記膜上的目標蛋白，這一抗體與報告酶相連接。當暴露于適當的底物時，報告酶驅動比色反應并產生顏色。由于各種原因，這傳統上發生在一個兩步法的過程中，雖然現在某些應用中可以用一步法的檢測方法。

      6、分析

       在未結合的探測劑被洗去之后，西方墨點法準備好檢測被標記和結合到目標蛋白質的探測劑。但在實際應用中，并不是所有的西方墨點法揭示蛋白質僅在一種膜上的一個條帶。

分類

       蛋白質免疫印跡法顯色的方式主要有以下幾類：

        1、放射自顯影

        2、底物化學發光ECL

        3、底物熒光ECF

        4、底物DAB呈色

       現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

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【麥克林蛋白質電泳試劑專題頁】

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